16S rRNA 시퀀싱과 Shotgun Metagenomic 시퀀싱 비교
- 주최 : Microbiome Insight
- 강사 : Ruairi Robertson, PhD
- 출처 : https://www.youtube.com/watch?v=SDbYFCAHX8s
Microbiome Insight에서 이메일 왔길래 클릭해보니 아래 강의 영상을 보내줬다. 간단한 비교 영상이지만 도움이 될 것 같아 정리해본다.
🟦 16s rRNA Sequencing
◾ 16S rRNA gene 를 타깃으로 하며, output은 16s rRNA의 유전자의 read 조각들 이다
◾ 여러 Pipeline(Qiimw, Muthur, Dada2)을 사용해 생물정보학 방법으로 분석
🟦 Shotgun Metagenomic Sequencing
◾ all genomic DNA 를 타깃으로 한다
◾ 과정
1. extract DNA from your sample
2. tagmentation a process which Cleaves and tags DNA with adapter sequences priming the fragmented DNA for ligation of molecular barcodes
3. cleaning up your fragmented DNA sample to remove tagmentation reagent impurities
4. performing PCR to amplify tagmented DNA samples as well as adding molecular barcodes to each sample
5. size selection and cleaning up of the DNA to remove impurities after the PCR steps
6. pool samples together in equal proportions
7. library quantification of the pooled samples and
8. sequencing pooled samples
◾ Pipeline : Mega hit or aligned to databases of microbial micro genes using pipelines such as metaflan and human
◾ the final results provide details of the relative abundances of bacteria fungi viruses and other microbes in the sample as well as the relative abundances of curated lists of microbial genes for example metabolic or antibiotic resistant genes
🟦 Head to Head Comparison
비용 (Cost)
◾ Shotgun은 amplicon보다 2~3배 이상의 돈이 소요되며, 소요된 금액은 시퀀싱 depth에 따라 다르다. depth에 따라 더 많은 시퀀싱은 더 많은 데이터를 생산, 그만큼 분석이 어렵다.
◾ shallow shotgun sequencing은 16S rRNA sequencing과 유사한 비용으로 deep한 Shotgun sequencing 사용하여 얻은 데이터의 97% 정도 유사하게 제공한다(가성비가 좋다는 말).
◾ 그러나 Shotgun은 Host DNA의 비율도 높아 추가적 단계가 많이 필요하다는 것도 고려할 점
분류 정확도(해상도) (Taxonomic Resolution)
◾ 16s sequencing은 대부분 bacteria나 Archea의 genus level 의 조성을 분석한다 (for example bifidobacteria)
◾ shotgun metagenomic sequencing은 bacteria와 다른 microorganisms을 species level에서 분석 가능하다 (for example bifidobacterium lungum or sometimes even a strain level for example bifidobacterium longum 35624 by profiling single nucleotide variants in metagenomic data)
◾ 그러므로 넓은 bacterial profiling에 관한 연구는 16s sequencing 가 적합하며, species와 strains level에서 여러 유기체를 분석하고 싶다면 metagenomic sequencing 방법이 더욱 강력하다
분류학적 범위 (Taxonomic coverage)
◾ 16s sequencing은 bacteria와 archaea를 주요 타깃으로 잡아낸다. 즉 오직 bacteria에만 관심 있다면 16s Gene sequencing이면 충분하다
◾ 그러나 여러 microbial kingdoms에 관심 있다면 shotgun metagenomic sequencing 이 더 적합하다
◾ 가장 중요한 것은 박테리아 바이러스와 진핵 미생물을 동시에 정확하게 식별하는 분석 방법은 DNA 추출 방법에 크게 좌우된다
Composition VS Function
◾ 현재 microbiome research의 연구는 profiles을 보는 것을 넘어서 Functional 한 부분도 분석한다. functional metagenomic data가 인간의 질병에서 ‘healthy’와 ‘diseased’를 구분하는 마커가 될 것이라고 본다
◾ 그러나 16s sequencing 분석방법은 비록 ‘picrust2’같은 Function 예측 프로그램이 있지만 완전한 데이터에 대해서는 알 수없다
◾ 반대로 shotgun metagenomic sequencing 은 microbial Gene의 기능적 content를 제공한다. 즉, microbiome functional profiles (such as antibiotic resistant genes or carbohydrate degrading genes)에 관심 있다면, shotgun sequencing 분석 방법이 더 좋은 선택지일 것이다
샘플 종류(Sample type)
◾ 16s sequencing은 DNA조각을 증폭하기 위해 PCR를 사용한다. 이때 host DNA가 같이 증폭될 가능성은 적다
◾ 그러나 shotgun metagenomic sequencing은 모든 DNA를 증폭함으로 non-microbial reads나 Host DNA가 같이 얻어질 가능성이 크다. 예를들어 Human DNA가 많이 묻어나는 Skin swabs이나 cheek swabs은 16s sequencing 방법이 더 적합하다
분석 능력 (Analysis Capabilities)
◾ 비록 shotgun metagenomic sequencing이 16s sequencing 보다 더 많은 데이터를 제공하지만, 데이터를 다루고 분석하는 방법이 더욱 복잡하다. 또한 컴퓨터 계산 시간도 더 오래 걸린다.
◾ 그러나 16s sequencing은 간단하게 OTU 테이블을 결과로 내놓으며 분석도 상대적으로 용이하다.
데이터베이스 (Databases)
◾ 16s sequencing분석 방법이 가장 대중적이기 때문에 데이터 베이스도 잘 선별(well-curated)되어있다,
◾ 그러나 Shotgun metagenomic sequencing 분석에 대한 full reference genomes은 아직 부족한 것이 실상이다. 그러므로 이전에 잘 알려지지 않았던 종들은 잘 분류되지 않는다. 또한 shotgun sequencing은 16s sequencing에 비해 더 적은 taxa를 분류한다. 그러나 full length를 분석하기 때문에 새로운(understudied) 미생물 유기체를 발견할 수 있다.