3세대 시퀀싱이란 2세대 시퀀서의 단점인 짧은 시퀀싱 서열 길이를 극복한 방법이며, long-read 시퀀싱이라고 불린다. 그러나 2세대에 비해 에러율이 높다는 단점이 있다. 3세대 시퀀싱을 전문으로 하는 회사는 Pacific Biosciences, Oxford Nanopore Technology, Quantapore (CA-USA), and Stratos (WA-USA)등이 있다. 이들은 single DNA molecules 수준에서 각기 다른 접근방식을 사용한다.
| Pacific Biosciences 사의 single molecule, real-time (SMRT)
- Single molecule real-time(SMRT) 이란 2010년도에 Pacific Biosciences에서 상용화된 long read 시퀀싱 방법이다.
- 염기와 결합된 형광물질을 측정한다는 점에서 illumina와 sanger와 비슷하지만, 2세대 이전 시퀀서는 빛의 강도가 약하거나 빛 간섭등으로 정확한 측정이 어려웠다. 이를 극복하기 위해, SMRT에서 새로 접목한 기술은 the zero-mode waveguide (ZMW)이다.
- ZMW는 silicon wafer와 알루미늄으로 이루어진 미세구멍 챔버를 뜻한다. 구멍의 지름은 70nm, 깊이는 100nm정도의 구조는 20 zeptoliters (20 X 10−21 liters) 부피의 빛만 측정 가능하게 한다. ZMW는 단일 효소와 서열이 들어갈 공간을 만들어 주변서, 합성 시 생기는 빛이 다른 서열결과를 간섭하지 못하도록 위한 공간을 만든다.
- Nanopore 기반 DNA sequencing기술은 1990년대에 상용화되었으며, 2012년 Oxford Nanopore Technologies (ONT)에서 MiniOn이라는 소형 기기를 출시하였다.
- ONT는 “Advances in Genome Biology and Technology meeting”에서 자사의 소형 시퀀서를 시용한 15분 만에 DNA를 추출하는 혁신적인 기술은 선보였다. Nanopore이름은 DNA 한 가닥만 통과할 수 있는 미세 구멍을 가진 pore를 통화시키면서 시퀀싱 하는 기술에서 가져온 것이다.
- Nanopore 시퀀싱은 이온의 흐름을 방해하는 염기에 의한 전류 변화를 측정하는 것이 핵심 원리이다.
Nanopore 시퀀싱 과정 살펴보기
Logsdon GA, Vollger MR & Eichler EE, Nat Rev Genet , 2020/ Laszlo A et al., Nat Biotechnol , 2014/Genomics Lab, Introduction to Nanopore sequencing, 2020
1. DNA는 먼저 processive enzyme phi29 polymerase에 부착되어 nanopore로 이동한다.
2. DNA helicase, exonuclease I, 나 oligonucleotides들이 DNA에 붙어서 이중 가닥을 풀고 pore안으로 서열을 이동시킨다.
3. 서열이 nanopore를 통과하는 속도는 phi29에 의해 조절되며, 수레바퀴처럼으로 이동시킨다.
