- 작성 2023.08.14
- 출처 : Sadowski, T., Klose, C., Gerl, M. J., Wójcik-Maciejewicz, A., Herzog, R., Simons, K., Reich, A., & Surma, M. A. (2017). Large-scale human skin lipidomics by quantitative, high-throughput shotgun mass spectrometry. Scientific reports, 7, 43761. https://doi.org/10.1038/srep43761
Large-scale human skin lipidomics by quantitative, high-throughput shotgun mass spectrometry
The lipid composition of human skin is essential for its function; however the simultaneous quantification of a wide range of stratum corneum (SC) and sebaceous lipids is not trivial. We developed and validated a quantitative high-throughput shotgun mass .
www.ncbi.nlm.nih.gov
Nomenclature
- 지질의 명명법은 아래와 같다
[lipid class]-[sum of carbon atoms in LCB and FAs]:[sum of double bonds in LCB and FAs];[sum of hydroxyl groups in LCB and FA]
- e.g.) EOS 70:3;2 : omega-hydroxy-shpingosine class에서 carbon의 개수가 70(= 길이), double bond의 개수가 2, hydroxyl group가 2개인 지질을 말함
- Sub-species의 경우에도, 같은 룰이 적용된다. 처음 부분은 Sphingoid base(LCB)이며, 두 번째 부분은 fatty acid(FA)이다.
- e.g.) 18:1;0–24:2;0
Method
재료)
- Methanol, propan-2-ol, chloroform, acetyl chloride and ammonium acetate
샘플링)
- 남녀(20–89세) 14곳에서 다양하게 채취
- Scrape biopsy, tape-stripping가 사용
- tape-stripped(D-Squame; D100 with 15s 압력)을 이용해서 제일 윗 층의 각질층을 없애고, D101을 통해 실제 샘플을 얻는다.
- triplicate samples를 left volar forearm의 인접한 부분에서 얻음. 첫 번째부터 20번째 까지 채취
- 10번째 이후부터는 2배 수로 채취, 그 사이는 버림
- 각 단계마다 blank disc sample 추가
지질추출)
- 2ml 튜브마다 900μL의 methanol 첨가 -> shaken at 1400 rpm at 4 °C for one hour.
-> 추출물을 multi-well plate로 옮기고 speed vacuum concentrator에서 건조
-> 건조된 추출물을 7.5 mM ammonium acetate in chloroform:methanol:propan-2-ol (1:2:4, V:V:V)의 액상혼합물과 섞는다
+) cholesterol의 경우, 추출물을 아세틸화 한 다음, 말리고 다시 액상 혼합물과 섞는다.
- 16 lipid class 관찰
Result
1. Tape stripping을 통한 지질체 분석은 쓸만한가?
- 두 번째 레이어 tape의 지질 추출양은 62± 14 μg 정도
- 재현성을 위한 지질 양 증가에 따른 CV(coefficient of varidation;변동계수) 측정 -> 15 값 정도, 일반적인 체외진단에서 사용되는 20 값보다 아래에 위치한다 -> 재현성 나쁘지 않다
요약) tape-stripping 방법 사용해도 괜찮다
2. Tape stripping을 통해 깊이에 따라 지질체를 추출
- 남, 여 left volar forearm에서 20 레이어 샘플링
- 7~5 레이어까지 가는 동안 지질 양의 85% 감소 -> topmost layer에 지질의 양이 가장 많다 (a)
- 샘플당 지질의 상대적 분포 비교하면, TAGs and DAGs가 층이 깊어질수록 감소/ Cerimide는 각질층 깊숙이 합성되기 때문에 깊이가 증가할수록 양도 증가/ cholesterol은 지질의 약 1/3을 구성/ Cholesterol esters는 감소 후, 5-7 layer에서 다시 증가 -> 이는 CE 중 짧은 CE는 sebaceous origin(피지선) 분포하고 좀 더 긴 species는 각질층에 존재하기 때문
- 지질들은 layer에 따라 큰 차이를 보이며, 그중 ceramides 덜 가변적이다.
요약) 지질도 layer에 따른 차이를 보임
3. Tape stripping을 통해 피부 위치에 따른 지질체 비교
- 14 site 비교
- 각 지역 특이적인 지질체가 남녀 간 유의한 상관관계를 보임. 그러나 forehead가 남녀 간 차이가 크다.
- 각 거리를 통해 계층적 a hierarchical clustering -> PCA에서 위치가 유사한 그룹끼리 묶임
-> cheek, forehead와 pectoral region, shoulder blade의 지질체가 가장 가깝게 묶임
- 등과 얼굴은 가장 많은 triglyceride를 가지고, 얼굴은 sebum gland가 풍부하다 -> 이러한 이유로 다른 그룹과 확연하게 구분되는 것
- sebum lipids (TAGs, DAGs)만 살펴보면, 전체 지질에 비해 남녀 간 차이가 적다. 특히 얼굴과 넥라인 쪽 샘플은 커다란 cluster로 뭉친다.
요약) tape-stripping을 이용해 사람의 여러 부위에 따른 차이를 관찰할 수 있음. 이때 f sebaceous lipids의 함량에 따라 많은 차이를 보임.
4. Tape stripping을 통해 성별에 따른 지질체 비교
- 나이가 다른 65명의 여성과 39명의 남성 비교
- 나이에 따른 지질체 전체 양 : 여성의 경우 나이와 전체 지질의 양이 유의한 음의 상관관계를 보임/남성의 경우 통계적 유의성 X\
- 여성에서 나이에 따른 TAG/DAG의 상대적인 지질체의 양도 눈에 띄게 감소/ cholesterol 은 증가
- cholesterol ester과 ceramide은 비교적 일정하게 유지
- 나이와 성별에 따른 차이는 sebum 분비를 조절하는 호르몬과 연결되어 있다고 설명할 수 있음(연령에 따라 eccrine gland; 땀샘의 수가 감소 혹은 기능의 저하를 보임)
- 여기서 volar forearm의 부위가 성별에 따른 특이를 구분할 수 있는 부위인지 아닌지 물음이 생김
-> PCA상에서 통계적 유의성을 보이지 않았고, 그림상으로 매우 겹침
-> Random forest를 통해 성별에 따른 차이를 학습 -> 정확도는 0.7±0.073/ sebum lipids를 제외하면 0.58± 0.099
=> 둘 다 만족스럽게 구분하지 못 함
확연하게 layer에 따른 차이를 보인다. 많은 연구에서는 7 layer전인 2~6 레이어를 사용한다.
이러한 이유는 5-7layer이후 급격한 물질 조성의 차이를 보이기 때문인 것 같다.
