| 개요
Sanger sequencing이란 Fredric Sanger(1928~2013)이 만든 시퀀싱 방법을 말한다. Fredric Sanger는 단백질 분자의 시퀀싱 방법과 DNA분자의 시퀀싱 방법으로 총 두개의 노벨화학상을 수상하였다.
DNA는 항상 5’-to-3’ 방향으로 합성된다. 합성 시에는 3’-OH와 5’-phosphate와 반응하여 phosphodiester결합이 형성되며 5’에 붙어있던 인산이 떨어져 나간다. DNA가 합성되는 과정에서 순서대로 사용된 염기를 알 수 있다면, 서열을 분석할 수 있다.
Fredric Sanger는 염기가 합성되는 단계를 멈추고, 멈추기 직전에 합성에 사용된 염기를 알아낸다면, 서열을 읽을 수 있다는 것에 아이디어를 얻었다. 이후 3’-OH가 존재하지 않는 ddNTP(dideoxynucleoside triphosphate)을 DNA의 합성 과정에서 첨가하여, 합성을 멈추는 Chain termination 이용한 Sanger sequencing 고안하였다.
| Sanger sequencing 방법
1. ddNTP를 이용한 chain-termination
전기영동을 사용하여 서열을 알아보는 수동적인(실험적인) Sanger sequencing 방법에서는 4개의 ddNTP를 사용하기 때문에, 총 4번의 PCR과 전기영동 과정이 필요하다. 그러나, 그 이후 형광분자 탐지 방법을 이용한 자동적인 Sanger sequencing 은 형광 분자가 라벨링 된 4 종의 ddNTP를 한 번에 넣고 PCR을 돌린다.
ddNTP를 첨가하여 DNA가 합성될 때, ddNTP가 합성 되면, 서열의 연장이 멈추어 버린다. 그 결과로 여러 길이의 DNA가 합성된다.
2. 여러 길이의 DNA조각을 크기 순으로 정렬
이때 우리는 너무나 많은 서열이 합성되었고, 서열의 수가 많은 만큼 서열을 정렬했을 때 염기가 하나씩 차이는 길이의 서열들이 있을 것이라 가정한다.
이후 전기영동을 통해 합성된 DNA를 크기(DNA서열의 길이 = fragment size)에 따라 정렬한다.
위의 그림은 수동적인 (실험적인) Sanger sequencing방법으로, 총 4번의 PCR과 4번의 전기영동을 거친 결과물이다.
이를 보면 조각의 길이에 따라 정렬되었을때, 각 band를 순서대로 읽어 내림으로서, 서열을 알아낼 수 있다.
자동적인 Sanger sequencing 방법에서는 한 번에 모든 염기를 넣고 PCR 돌린 후, 하나의 gel에서 전기영동을 실시한다.
3. 정렬된 서열을 읽어내기
자동적인 Sanger sequencing에서는 전기영동된 band에 레이저를 쏘면 형광분자가 부착된 ddNTP가 반응한다. 반응하는 빛의 색을 읽어서 각 ddNTP가 어떤 염기를 나타내는지 판별한다. 이 과정의 결과물은 아래 그림처럼 나타나는데, 각 형광분자의 peak를 보여주며 chromatogram이라고 부른다.
chromatogram에서 가장 높은 peak를 보이는 염기를 base염기로 인식하고 읽어 내려간다.
Sanger sequencing은 오래된 기술임으로, 기술적 신뢰도가 높고 자동화 시스템이 잘 갖추어져 있다. 만약 짧은 서열을 분석할 경우 정확도가 높은 Sanger시퀀싱이 좋은 선택지이다. 그러나 이 방법은 앞부분의 20~40bp와 말단 부분의 퀄리티가 떨어진다.
Sanger 시퀀싱은 유전체 분석의 길을 열어준 방법으로, capillary sequencing 혹은 1세대 시퀀싱 방법이라고 불린다.
질문 및 피드백 환영합니다!
출처
- https://en.wikipedia.org/wiki/Frederick_Sanger
- https://blog.edvotek.com/2014/09/08/understanding-dna-sequencing-part-1/
