[Phyloseq] R에서 phyloseq 데이터로 LefSe 분석하기(micobiomeMarker/microbial 패키지 사용) + 에러

작성 : 2022-10-24

수정 : 2023-06-04 (microbial 패키지 추가)

 

 

 

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🟦 목표

1. Microbiome의 marker 미생물을 찾는데 많이 사용되는 LefSe 분석에 대해 알아보고

2. R을 이용하여 분석을 후 시각화해 보자

 

 

🟦 LefSe 분석이란?

LDA (linear discriminant analysis)란

이는 차원축소 방법 중 하나로, 간단히 말해 기존의 데이터의 class들을 잘 나눌 수 있는 선을 찾고 새로운 데이터가 나타났을 때 사전에 찾은 선을 기준으로 어떤 class인지 분류해 주는 알고리즘이다

(출처 : https://m.blog.naver.com/PostView.naver?isHttpsRedirect=true&blogId=ysd2876&logNo=221212453426)

 

LEfSe (LDA effect size) 란?

LDA를 이용하여 그룹을 비교할 때, 각 그룹에서 특징적인 미생물은 무엇이 있는지 알아내는 단계를 말한다.

예를 들어, 사람의 장과 혀의 미생물을 분석했을 때, 각 혀와 장에서만 특별히 조성이 높은 생물을 찾아내는 것이다. 

 

분석 방법은 아래와 같은 3단계를 거친다

(a) Kruskal Wallis test를 통해, feature(=OTU, ASV, taxa)의 분포가 일단 각 그룹(class 1 vs class 2)에서 유의미하게 차이가 있는지 없는지 판별한다 

- 여기서 B, D, E, Y가 유의하다고 판별되었다.

(b) Wlcoxon test로 class 1, 2안의 각 sub class유의 한 차이가 있는지 pairwise로(짝지어서) 비교한다  

-  각각의 B, D, E에서 유의하다고 판별됨

(c) 각 feature의 effect size를 측정하기 위해 LDA가 사용된다. 

- python기반으로 제작되었으며, 온라인(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy) 또는 linux환경에서 각각 분석이 가능하다.

 

 

🟦 R에서 분석해 보기 1 : microbiomeMarker

R에서 lefse분석을 하려면 lefser이나 microbiomeMarker이 필요하다. 

이 중 microbiomeMarker을 사용할 것이다. 이는 2021년에 개발되었으며, 추가적인 사항은 https://yiluheihei.github.io/microbiomeMarker/index.html 여기에서 확인할 수 있다.

+) 만들어진 지 얼마 안 된 만큼 오류도 많다. 그러나 (개인적으로) bash환경에서 lefse를 분석하는 것과 비슷한 command를 쓰고, 직관적이다.   

 

 

 패키지 설치 

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) {
  install.packages("BiocManager")
}

BiocManager::install("microbiomeMarker")
library(microbiomeMarker)


library(ggplot2)
library(pheatmap)
library(tidyverse)

 

분석 데이터 

microbiomeMarker 패키지에 있는 예제데이터를 사용할 것이다. 

data(kostic_crc)
kostic_crc
#phyloseq-class experiment-level object
#otu_table()   OTU Table:         [ 2505 taxa and 177 samples ]
#sample_data() Sample Data:       [ 177 samples by 71 sample variables ]
#tax_table()   Taxonomy Table:    [ 2505 taxa by 7 taxonomic ranks ]


sample_data(kostic_crc)  # 데이터 구성을 확인해보자

DIAGNOSIS를 보면 Healthy와 Tumor로 나뉜다.
그렇다면 우리는 건강한 그룹과 종양 그룹을 대표하는 미생물을 찾고자 할 것이다. 

 

LefSe 분석하기

set.seed(0)

mm_test <- run_lefse( kostic_crc,
                      wilcoxon_cutoff = 0.01,
                      norm = "CPM", 
                      group = "DIAGNOSIS",
                      taxa_rank = "all",
                      kw_cutoff = 0.01,
                      multigrp_strat = TRUE,
                      lda_cutoff = 4
)

-  wilcoxon_cutoff = wilcoxon 검정의 p-value
- norm = 정규화 방법, lefse 분석에서는 CPM이 default값이며, 이 방법을 추천 
- group = 각 데이터에서 분석하고자 하는 데이터의 열 이름 
- taxa_rank = 보고자 하는 계통수의 레벨
- kw_cutoff = kruskal wallis 검정의 p-value값
- multigrp_strat = TRUE
- lda_cutoff = lefse결과에서 특정 LDA 점수 이상만 보겠다 

(출처: https://yiluheihei.github.io/microbiomeMarker/articles/microbiomeMarker-vignette.html)

 

 

- CPM  : The counts per gene were normalized to CPM by dividing it by the total number of mapped reads per sample and multiplying by 1 × 10^-6 

https://www.reneshbedre.com/blog/expression_units.html

- 우리가 비교자 하고 싶은 그룹은 DIAGNOSIS이며, 각 test(wilcoxon_cutoff, kw_cutoff)의 p-value값의 한계점(alpha)을 0.01로 잡으며,  LDA score가 4점 이상인 feature만 관찰하겠다는 뜻이다.

- taxa_rank에서 Species만 검색하고 싶다면 taxa_rank = "Species"로 변경하면 된다 

 

 

🚨🚨Error🚨🚨

만약 아래와 같은 에러가 뜬다면 bootstrap_fraction을 기본값일 2/3보다 더 높게 설정해 보자. 4/5 -> 6/10 -> 8/10으로 늘려가는 것을 추천한다. 혹은 bootstrap_n을 너무 높게 잡았을 때, 이 값을 낮추면 해결된다.

관련 사항을 깃허브에도 문의해봤지만 본질적인 해결책은 찾지 못했다. 

base::stop("infinite or missing values in 'x'")

 

 

 

 

 

 

 

이제 결과를 보자

marker_table(mm_test)

Healthy그룹을 대표하는 feature 15개와 Tumor 그룹을 대표하는 feature 6개가 검출되었다.

 

 

 

이를 각 LDA score를 기준으로 시각화해 본다면?

plot_ef_bar(mm_test)

 

 

또한 cladogram으로도 볼 수 있다

plot_cladogram(mm_lefse, color = c(Healthy = "darkgreen", Tumor = "red"))

 

 

 

 

각 원의 지름은 각 taxon의 풍부도(abundance)를 나타내며, 색의 농도로 이를 표현했으며, 색은 각의 class에서 높은 풍부도를 보이는 taxon을 표시한 것이다. 

 

 

 

 

 

🟦 LDA score구하는 다른 패키지 : microbial

 

만약 위의 패키지에서 에러가 난다면 microbial을 사용해보길 권한다. 

 

microbiomeMarker 패키지는 input 파일의 taxonomy 데이터의 열 이름이 Kingdom, Phylum, class, order, family, genus, species에 속하지 않으면  에러가 난다. 

 

만약에 kegg pathway 데이터를 보고 싶을 때 colnames이 pathway1, pathway2라면 이 이름을 위의 형식으로 변환해야하는 번거로움이 있다. 그러나 microbial 패키지는 그런 과정을 거치지 않아도 된다. 

 

 

또한 microbial  패키지도 phyloseq을 바로 input 파일로 사용 가능하다. 

 

 

# BiocManager::install("microbial")
# BiocManager::install("microbiome")
library(microbial) 
library(microbiome)


# lefse 계산
res <- ldamarker(kostic_crc ,group="Group") 

# plot 그리기 
lefse_plot <- plotLDA(res,
                      group=c("Healthy","Tumor"), 
                      lda=5, 
                      pvalue=0.05, 
                      color = c("red","green"), 
                      fontsize.x = 7,
                      fontsize.y = 8)
lefse_plot

 

 

문제는 두 패키지의 결과가 완전히 같지 않다. 개인적인 생각으로는 세부적인 계산 단계화 bootstrap에 따른 차이로 보여진다. 

그러나 논문에 기재하기 위해서는 lefse module을 사용하는 것이 가장 신뢰성이 높을것이다. 

 

 

 

 

 

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🟦 추가적으로 작성할 글

- 차후에는 온라인(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)으로 lefse분석을 돌리는 방법을 알아보자

 

 

 

🟦 Reference

LDA

https://m.blog.naver.com/PostView.naver?isHttpsRedirect=true&blogId=ysd2876&logNo=221212453426

LefSe

Segata, N., Izard, J., Waldron, L. et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biol 12, R60 (2011). https://doi.org/10.1186/gb-2011-12-6-r60

microbiomeMarker

https://yiluheihei.github.io/microbiomeMarker/articles/microbiomeMarker-vignette.html#visualization

https://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/microbiomeMarker/inst/doc/microbiomeMarker-vignette.html

https://rpubs.com/mohsen/lefse_analysis_cleaned_prevalence_phyloseq